反转录体系 · qPCR体系 · 引物计算 · 实验流程指导
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
|---|---|---|---|
| 去除gDNA | 42℃ | 2 min | 1 |
| 保持 | 4℃ | Hold | - |
| 反转录 | 37℃ | 15 min | 1 |
| 酶失活 | 85℃ | 5 sec | 1 |
| 保持 | 4℃ | Hold | - |
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
|---|---|---|---|
| 预变性 | 95℃ | 30 sec | 1 |
| 变性 | 95℃ | 5 sec | 40 |
| 退火/延伸 （荧光采集） |
60℃ | 30 sec |
| 步骤 | 温度 | 时间 | 采集速率 |
|---|---|---|---|
| 步骤1 | 95℃ | 15 sec | - |
| 步骤2 | 60℃ | 1 min | - |
| 步骤3 | 95℃ | 1 sec | 0.5℃/sec |
选择两步法：RNA中gDNA含量很高，或对gDNA去除效果要求很高时。
选择All in one：RNA质量较好（gDNA残留少），或RNA浓度较高、目标基因拷贝数高时。All in one操作更便捷省时。
可以直接使用。cDNA原液使用体积不要超过qPCR反应总体积的10%（20μl体系中不超过2μl）。如果荧光信号偏低，可尝试将cDNA原液稀释2~10倍后使用。
正常的qPCR扩增效率应在90%~110%之间（对应标准曲线斜率为-3.1~-3.6）。R²值应≥0.99。熔解曲线应呈现单一峰形，表明扩增特异性好。
Total RNA中混入的gDNA可直接作为反应模板进行扩增，造成实验结果假阳性。gDNA Clean Reaction Mix可有效去除残留的gDNA，确保定量结果准确。
反转录产物：立即使用可放4℃或冰上；短期保存-20℃；长期保存-80℃。
qPCR产物：建议-20℃保存，避免反复冻融。