📋 实验流程概览
步骤1：RNA 提取与质量检测
步骤2：基因组DNA去除 (gDNA Clean, 42°C 2min)
步骤3：反转录反应 (37°C 15min → 85°C 5sec)
步骤4：qPCR扩增 (95°C 30sec → 95°C 5sec/60°C 30sec ×40循环)
📊 样本信息
需要qPCR检测的样本数
阴性对照+重复孔
总反应数：22 孔 (样本 + 增益)
⚗️ qPCR反应体系 (20μl)
μl/样
μl/样
μl/样
μl/样
μl/样 (自动计算)
单样总体积：
20 μl
⚡ 快速配置模板
🧪 Mix配制表
| 组分 | 单样(μl) | Mix总量(μl) |
|---|
💡 配制建议：先配制Mix混合液，涡旋混匀后分装到各反应孔中，最后加入cDNA模板。
📝 分装说明
分装Mix至每孔：
15 μl
每孔加入cDNA：
5 μl
最终反应体系：
20 μl
📦 试剂使用量汇总
⚠️ 注意事项
- • 所有操作需在冰上进行，使用RNase-free耗材
- • 引物终浓度通常为0.2μM，可根据需要调整(0.1-1.0μM)
- • cDNA添加量不应超过qPCR反应总体积的10%
- • 建议每个样本设置2-3个技术重复
- • 使用ABI QuantStudio 5等仪器时，熔解曲线为必须步骤
🔄 反转录反应配置 (Evo M-MLV RT Mix Kit)
两步法 (推荐用于gDNA含量高的样本)
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| gDNA Clean Reaction Mix Ver.2 | 2 μl |
| Total RNA | ≤ 1 μg |
| RNase free water | up to 10 μl |
| 反应条件 | 42°C 2min → 4°C Hold |
然后加入4μl 5X Evo M-MLV RT Mix + RNase free water至20μl
All-in-one (适用于RNA质量好的样本)
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| gDNA Clean Reaction Mix Ver.2 | 2 μl |
| 5X Evo M-MLV RT Reaction Mix Ver.2 | 4 μl |
| Total RNA | ≤ 1 μg |
| RNase free water | up to 20 μl |
| 反应条件 | 37°C 15min → 85°C 5sec → 4°C Hold |