🧬 DNA/RNA与基因表达

分子生物学技术

从PCR到基因编辑，系统掌握现代分子生物学技术的原理和应用。

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免责声明： 本内容仅供医学学习参考，不作为临床诊断依据。

📊 学习进度

8个知识模块

预计学习时间：35分钟

01 核酸电泳

❓ 琼脂糖凝胶电泳

分离范围

0.1-25kb DNA片段

分离原理

分子大小 + 构象

❓ 电泳迁移影响因素

① DNA分子大小

小分子迁移快

② 琼脂糖浓度

浓度高分离小片段效果好

③ 电压

电压高迁移快但分辨率下降

❓ DNA构象对迁移影响

相同大小DNA，不同构象迁移速度不同：

超螺旋 > 线状 > 开环

02 核酸杂交

❓ 核酸杂交原理

互补单链核酸在适当条件下复性配对形成双链。

❓ Southern blot

检测对象

DNA

应用

基因拷贝数、基因重排、RFLP分析

❓ Northern blot

检测对象

RNA

应用

基因表达水平、mRNA大小

❓ Western blot

检测对象

蛋白质

原理

抗体-抗原特异性结合

💡 记忆：South(DNA) → North(RNA) → West(蛋白质)

03 PCR技术

❓ PCR原理

体外DNA扩增技术，通过变性-退火-延伸循环指数级扩增DNA。

❓ PCR反应体系

模板DNA

待扩增DNA

引物

特异性扩增

Taq DNA聚合酶

耐热DNA聚合酶

dNTPs

底物

❓ PCR三个步骤

1 变性（94-98°C） → 双链解开

2 退火（50-65°C） → 引物结合

3 延伸（72°C） → DNA合成

❓ PCR产物特点

指数扩增

2ⁿ（n为循环数）

特异性强

由引物决定

灵敏度高

可检测单拷贝基因

❓ RT-PCR

逆转录PCR

RNA → 逆转录 → cDNA → PCR扩增

🏥 临床应用：检测病毒RNA（如HIV、新冠病毒）

04 DNA测序

❓ 第一代测序（Sanger法）

原理

双脱氧链终止法

特点

准确性高，读长可达1000bp

应用

金标准，临床基因检测

❓ 第二代测序（NGS）

特点	说明
高通量	并行测序数百万条DNA
低成本	大幅降低测序成本
短读长	通常50-300bp
应用	全基因组测序、转录组测序

❓ 第三代测序

单分子测序

无需PCR扩增

长读长

可达数十kb

05 基因克隆

❓ 基因克隆载体

载体类型	容量	特点
质粒	<10kb	最常用，易操作
λ噬菌体	9-23kb	高效感染
粘粒	35-45kb	大片段克隆
BAC/YAC	100kb-2Mb	基因组文库构建

❓ 限制性核酸内切酶

识别特定DNA序列并切断磷酸二酯键。

EcoRI识别：5'-GAATTC-3' → 在G与A之间切断

💡 切割类型：平末端/粘末端

❓ DNA连接酶

T4 DNA连接酶

连接粘末端/平末端，需ATP

作用

形成3',5'-磷酸二酯键

06 基因编辑

❓ CRISPR-Cas9原理

1 sgRNA引导Cas9到靶DNA

2 Cas9切割双链DNA

3 细胞修复产生基因突变

❓ CRISPR-Cas9组成

Cas9蛋白

DNA内切酶，切割双链

sgRNA

单链向导RNA，识别靶序列

💡 靶序列要求：需PAM序列（NGG）

❓ DNA双链断裂修复

NHEJ（非同源末端连接）

易错修复，产生插入/缺失突变

HDR（同源重组修复）

精确修复，需模板DNA，用于基因敲入

❓ 其他基因编辑技术

ZFN

锌指核酸酶

TALEN

转录激活样效应因子核酸酶

💡 优势比较：CRISPR设计简单、效率高、成本低

07 基因编辑应用

❓ 基因编辑应用领域

基础研究

基因功能研究、疾病模型构建

基因治疗

遗传病治疗、癌症免疫治疗

农业

转基因作物、动物育种

❓ 伦理与安全

⚠️ 基因编辑伦理问题

胚胎基因编辑争议
脱靶效应风险
生态影响不确定
遗传改变不可逆

08 分子诊断技术

❓ 常用分子诊断技术

PCR

感染性疾病、遗传病

实时荧光定量PCR

定量检测，病原体载量

基因芯片

多基因同时检测

测序技术

未知病原鉴定、肿瘤基因检测

❓ 分子诊断临床应用

🏥 临床应用：

感染性疾病快速诊断（病毒、细菌）
遗传病筛查与诊断
肿瘤早期筛查与靶向治疗
药物基因组学检测

📝 真题练习

【真题】PCR三个步骤

💡 变性、退火、延伸

【真题】Sanger测序原理

💡 双脱氧链终止法

【真题】Southern blot检测

💡 DNA

【真题】Northern blot检测

💡 RNA

【真题】CRISPR-Cas9组成

💡 Cas9蛋白 + sgRNA

【真题】NHEJ修复特点

💡 易错修复，产生插入/缺失

【真题】BAC载体容量

💡 100-300kb

🔄 快速回顾

PCR步骤

变性→退火→延伸

核酸杂交

South(DNA), North(RNA), West(蛋白质)

CRISPR-Cas9

Cas9 + sgRNA，需PAM序列(NGG)

DSB修复

NHEJ(易错)、HDR(精确)